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ELISA實驗標本的采集、處理和保存

發布時間:2017/7/14 14:22:07      閱讀次數:1131

ELISA實驗標本的采集、處理和保存

ELISA實驗標本的采集、處理和保存

 

能夠應用ELISA 實驗的樣本種類很多,有血清,血漿,細胞上清,細胞裂解液,尿液,關節滑液,腦脊液,肺泡灌洗液,各種組織的組織勻漿;采集和處理的方式都不相同。下麵就列出了biotnt 收集的給類樣本的采集、處理和保存方式。方法大多出自文獻和試劑盒說明書,部分方法經Biotnt 驗證過,但有的方法並沒有實際操作過,所以,以下方法僅供參考。

 

 

一、ELISA實驗中血清的采集、處理和保存;

1、 真空采血針采集2ml新鮮血液,加入無菌試管中;

2、 采血後室溫靜置1小時;

3、 將采集血液用離心機4℃,2500rpm離心10min,,將離心好的勻漿留上清,棄下麵沉澱。

4、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

5、 根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。 

大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP為標記的 ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。此外還應避免細菌汙染,因為菌體中可能含有含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。血清標本宜在新鮮 時檢測。如在冰箱中保存過久,其中的可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深。

 

二、ELISA實驗中血漿的采集、處理和保存;

1、 真空采血針采集2ml新鮮血液,加入無菌試管中;

2、 1:9加入抗凝劑(EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉),30分鍾內於冰上分離血漿以減少血小板的汙染;(也可以直接用抗凝管采集);

3、 將采集血液用離心機4℃,2500rpm離心5min,,將離心好的勻漿留上清,棄下麵沉澱。

4、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

5、 根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。 請注意指標說明書上對於抗凝血劑是否有特殊要求,建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等於血清。

注意事項:製備血漿標本需借助於抗凝劑EDTA,抗凝不完全的標本因纖維蛋白原幹擾而造成假陽性。

 

三、ELISA 實驗中尿液的采集、處理和保存;

1、 采集尿液樣本500ul,加入無菌試管中;

2、 將采集血液用離心機4℃,2500rpm離心10min,,將離心好的樣本留上清,棄下麵沉澱。

3、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

4、 根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

四、ELISA 實驗中腦脊液的采集、處理和保存;

1、采集腦脊液樣本,加入無菌試管中;

2、將采集血液用離心機4℃,2500rpm離心10min,,將離心好的樣本留上清,棄下麵沉澱。

3、取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

4、根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

五、ELISA 實驗中細胞上清液的采集、處理和保存;

1、采集細胞培養上清液500ul,加入無菌試管中;

2、將采集血液用離心機4℃,2500rpm離心10min,,將離心好的勻漿留上清,棄下麵沉澱。

3、取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

4、根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

六、ELISA 實驗中細胞裂解液的采集、處理和保存;(需要測蛋白濃度)

1、 取細胞培養板或細胞懸液,PBS(PH7.2-7.4)洗滌細胞培養板1-2次。

2、 通過反複凍融或加入組織蛋白萃取試劑(裂解液),使細胞破壞並放出細胞內成份。

3、 將采集血液用離心機4℃,2500rpm離心20min,,將離心好的勻漿留上清,棄下麵沉澱。

4、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

5、 根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

七、ELISA 實驗中肺泡灌洗液的采集、處理和保存;

110%水合氯醛溶液,腹腔麻醉。

2打開腹腔,另取10ml注射器行下腔靜脈采血,盡可能將血放盡。

3在冰麵上對左肺進行肺灌洗。取37℃生理鹽水5ml,分三次灌洗:2ml1.5ml1.5ml灌洗。回收率在70%以上。

4肺泡灌洗液用離心機4℃,1500rpm離心10min。

5、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

6根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

八、ELISA 實驗中關節滑液的采集、處理和保存;

1、 口腔關節:患者取坐位,常規消毒後,作皮下及關節後區局部浸潤麻醉。然後囑患者大張口,采用裝有2ml生理鹽水的注射器(5號針頭)作關節上腔 穿刺,髁後進針,針尖方向斜向前、內、上,抵達關節結節後斜麵後稍後退,回抽如發現有淡黃色液體,即表明已進入關節上腔,注入2ml生理鹽水,反複注入、 回抽五次。

   膝骨關節滑液:無菌穿刺取得關節液。

2關節液用離心機4℃,1500rpm離心15min,將離心好的勻漿留上清棄下麵沉澱。

3、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

4根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

九、 ELISA實驗中各類組織勻漿(容易勻漿的組織)的采集、處理和保存;(需要測蛋白濃度)

1采集組織在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭幹,稱重,剔除附屬的結締組織,稱取組織塊。

2用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質或生理鹽水的體積總量應該是組織塊重量的9倍,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天然時操作要在冰水浴中進行,將盛有組織 的小燒杯放入冰水中)。

3勻漿的方式有多種: 

a) 手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩餘的1/3勻漿介質或生理鹽水衝洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進行勻漿,左手持勻漿管將下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗杆垂直插入套管中,上下轉動研磨數十次(68分鍾),充分研碎,使組織勻漿化。

b) 機器勻漿:用組織搗碎機1000015000r/min上下研磨製成10%組織勻漿,也可用內切式組織勻漿機製備(勻漿時間10/次,間隙30秒,連續35次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

4將製備好的10%勻漿用離心機4℃,3000rpm離心15min,將離心好的勻漿留上清棄下麵沉澱。

5、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

6根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

十、ELISA實驗中各類組織勻漿(不易勻漿的組織)的采集、處理和保存;(需要測蛋白濃度)

7采集組織在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭幹,稱重,剔除附屬的結締組織,稱取組織塊。

8用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質或生理鹽水的體積總量應該是組織塊重量的9倍,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天然時操作要在冰水浴中進行,將盛有組織 的小燒杯放入冰水中)。

9勻漿的方式有多種: 

a) 手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩餘的1/3勻漿介質或生理鹽水衝洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進行勻漿,左手持勻漿管將下 端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗杆垂直插入套管中,上下轉動研磨數十次(68分鍾),充分研碎,使組織勻漿化。

b) 機器勻漿:用組織搗碎機1000015000r/min上下研磨製成10%組織勻漿,也可用內切式組織勻漿機製備(勻漿時間10/次,間隙30秒,連續35次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

c) 超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發生儀,用40安培,5/次,間隙10秒反複35次。

10將製備好的10%勻漿用離心機4℃,3000rpm離心15min,將離心好的勻漿留上清棄下麵沉澱。

11、 取上清。 分裝凍存備用,

2-8℃下,可放置保存24-48小時;

-20℃下,可放置保存1個月;

-70℃下,可放置保存6個月;

12根據你的實驗需要,取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 

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